Молекуларна ресеарцх метход генетски

За истраживање и идентификацију варијанти у ДНА структури користи молекуларне генетске методе. За сваку ДНК региона који истражује овај регион хромозома, ген или алел, методе разликују. У основи сваког молекуларну генетичку методу садржи неке или друге манипулације РНК и ДНК. Све ове методе карактерише огроман сложености, без лабораторијским условима не може извршити, а особље мора бити високо квалификовани. Овај рад се одвија у неколико фаза.

фазе

Прво, РНК или ДНК узорци се произведе. Овде, молекуларне генетике метода може применити на практично било који материјал: капи крви, леукоцита, фибробласти културу, мукозе (огребао), чак фоликули, - ДНК се може добити из било ког узорка. Погодан је да се користи било молекуларно генетичке методе и њихове различите опције и већ дуго изолована ДНК је чувани замрзнути. Друга фаза је посвећена акумулацији жељених фрагмената (амплификације) ДНК, јер обезбеђује ланчане реакције полимеразе ин витро (ин витро без учешћа живог организма). Као резултат тога, одабрани фрагмент ДНК умножава од овога ланчане реакције и износ ДНК повећава буквално милионе пута.

Трећи корак у молекуларним методама генетског истраживања Претпоставља ограничење вишеструко ДНК (тхис фрагментације, кидање или резање). Рестрицтион врши електрофорезом на полиакриламид или агароза гелу. Ова молекуларно-генетичка метод проучавања ДНК фрагмент омогућава свима да одређени положај у гел. Након тога, гел се третира са етидијум бромидом, способан да се везује ДНК, зрачење са ултраљубичастим светлом, онда је могуће посматрати луминесценције делова. Молекуларне генетске дијагностичке методе су различити и бројни, али прва два корака су заједнички за све. Али у циљу идентификације ДНК фрагмената, гел се може бојити, а многи других постојећих метода.

врста

Најдиректнији и распрострањени Методе за детекцију микобактерија могу укључити молекуларну генетског ДНК методом изнад учења. Његова суштина је да, у циљу идентификовања скенирања ланца материјал специфичних фрагмената ДНК патогена. Молекуларне генетске дијагностичке технике још увек нема много ефикаснији начин да препознају такве болести као туберкулоза. Користећи ланчану реакцију полимеразе (ПЦР), можете бити сигурни да ће оригинални ДНК повећати број копија у милион пута, то јест, биће амплификација, а то ће приказати резултате. Ниво осетљивости је веома висока - више од деведесет пет процената, што је главна предност ове методе.

Остатак молекуларно-генетичким методама истраживања о ефикасности приноса вишеструких копија буквално двоструко, јер у овом случају израда узорак показује специфична секвенца олигонуклеотид повећана на сто и шест пута. Чак и дијагноза култура туберкулозе респираторног система значајно смањити осетљивост. Због тога модерна медицина заснива на молекуларно-генетичких метода дијагностике туберкулозе. А описано метод је ефикасна нарочито када се ради патогенима високе антигени варијабилности, утврдити да другу страну много теже - захтева посебне хранљивој подлози и култивацију дуго. Биохемијских и молекуларних генетске методе дају веома различит утицај на резултате.

дијагноза туберкулозе

Марсхалл ПЦР дијагностика туберкулозе најчешће користи та ДНК секвенце које су специфичне за сва четири врсте болести. Да би се постигао овај циљ често користе прајмера који детектују секвенца елемената (ИС-986, ИС-6110), јер ови елементи карактеришу високо миграторних врста Мицобацтериум туберцулосис и увек присутна више примерака у геному. Такођер екстракција ДНК може бити изведена из чистих култура и Цлиницал (спутума болесника) било којом другом погодном методом. На пример, постоје Боом поступак где се лизу пуфер се користи на основу гуанидин тиоцијанат и силике као носећим ДНК. Број пацијената који се разликују лоше бактериолошки сваке године повећава, а самим тим у клиничкој пракси је успоставио потпуно различит ниво организације: молекуларно-генетски метод истраживања ДНК је играо главну улогу у дијагностици.

Међутим, морамо признати да није без мана. Употреба ПЦР метода често доноси велику количину лажно позитивне резултате, а разлог је не само техничке грешке, али и карактеристике самог метода. Осим тога, помоћу ове методе дијагностике се одредила вијабилност микобактерија, који су идентификовани, просто је немогуће. Али то недостатак није најважнија. Молекуларни генетички методе ПЦР дијагностике подразумевају ризик од контаминације микобактеријске ДНК. Захтеви за сертификацију за ову разлога за ПЦР лабораторије намењен искључиво тешко, они захтевају присуство три изолованих соба. ПЦР технологију је модеран и врло сложен, захтева употребу одговарајуће опреме и високим обучени особље.

бацтериосцопи

Када се дијагноза резултати анализе морају бити у поређењу са другим подацима: клиничког прегледа, радиографије, микроскопију, култура, чак и одговор на одређену лечења су веома важни. У овој серији, студије ПЦР је само једна од компоненти. Детецт патоген у раној дијагностици могу бити најједноставнији и најбржи методе - бактериолошки.

Постоји користи светло микроскоп (бојење Зиехл-Неелсен) и флуоресценција (бојање флуороцхромес). Предност је брзина брис резултата. Али његова мана је с правом сматра ограничени капацитет због ниске осетљивости. Међутим, овај поступак је дат препоруке СЗО као најекономичнији и земљу да открије туберкулозе пацијената. Детекција микобактерије бактериолошког метода има предвиђања вредност и процењени квантитативно бактеријски избацивање. Много више самопоуздања да се баве собом молекуларних истраживачких метода туберкулозе генетских.

kulture

Боље откривање микобактерија препознати културне студије. Сетва патолошки материјал је направљен у медијум јаја: Мордовски, Финн ИИ, Љ, и слично. Одреднице отпорности микобактерија на лекове и посредне доказе о ефикасности великог броја микобактерија и њихових колонија ин витро, ако примењеног метода истраживања културе. Да се повећа проценат изоловања микобактерија инокулације патолошког материјала се одржава на више окружења.

Задовољавање потреба бројних културних, патогена, укључујући донације и течности. Користи се у овом систему и аутоматизован тип мерење раста ВАНТЕС. Усеви морају бити одржана у инкубације у трајању до седам до осам недеља. До тог времена усева са недостатком раста може се сматрати негативан. Најефикаснији начин да открије Мицобацтериум туберцулосис размотри биолошких узорака: дијагностичких материјала инфицирају заморце, који су изузетно подложни ТБ.

neke фигуре

Интересантно поље проучавања које је отворио ПЦР дијагностика био да се испита М. туберцулосис - латентне инфекције. Савремени концепт ТБ инфекције сугерише да је од стотину људи који су били у контакту са М. туберцулосис, деведесет може добро да се заражени, али само десет од њих су активни болест се развија. Други имају ТБ имунитет, а због деведесет посто случајева инфекција остаје латентна. Открије узорак је помогла могућност молекуларног метод.

Генетичари кажу да педесет и пет процената оних чији усеви патолошки материјал су били негативни, и осамдесет процената људи заражених М. туберцулосис, али тече без радиографичких манифестацијама болести, ПЦР позитивни одговори примио. То је генетски дијагностичка метода помогао да се идентификују пацијенти угрожене ПЦР студијама, са резултатима њихових анализа (микроскопијом и култура) је негативна, а субклинички инфекција М. туберцулосис био присутан.

savremena истраживања

Руска Федерација и бактериолошки лабораторије користити убрзани метод апсолутних концентрацијама: нитрат редуктазе активност микобактерија тестирана Гриесс реагенсом. Анти-ТБ центри користе метод који омогућава да се утврди отпорност на лек. Овај сеединг у течним подлогама где аутоматизован радиометријски и флуоресцентни рачуноводственог система раст микобактерија. Таква анализа се врши брзо - до две недеље.

Тренутно, нови методи су развијени: отпорност на лекове микобактерија се мери на нивоу генотип. Проучавање молекуларних механизама гена отпорности и показује присуство у микобактерије. Ови гени су повезани са резистенцијом на неких лекова. На пример, Каса гена, Инха, катг отпоран на изониазид, рпоБ ген - рифампицин 16Сп РНК гена и рпсЛ - стрептомицин, емб1 - на етамбутол, Гира - флуорокинолон итд.

мутације

Модерни Дијагноза значајно повећава метод молекулску-генетски нивоу за проучавање ДНК и дозволио да врши масовна студије мутација у њиховој целокупној спектру. Сада знамо да су најчешћи мутације у 516, 526 и 531 кодона рпоБ гена, и идентификовали отпорност на различите лекове. Постоји читав низ метода за куцањем микобактерија помоћу не само традиционалне методе - биохемијских, биолошких и културе, али и широкој употреби савремене молекуларно генетске технике. Већ постоје адекватне и пружају исправан метод дијагнозе за детекцију моногенских болести. Они су засновани на ДНК студијама у тачном подручју одређеног гена. Ово је обично комплексан процес, дуготрајан и скуп процес, али подаци који пружају молекуларне генетске анализе, је много прецизније и информативан од података свих других анализа.

Одавно је познато да је ДНК не мења за читав живот организма да је на било који једром ћелија однакова, а то омогућава да се анализе апсолутно свим ћелијама организма, у било којој фази онтогеније. Оштећени ген може бити откривена пре појаве првих симптома до потпуне клиничке болести, као код здравих хетерозиготних људи, али има мутацију у гену. Молекуларне дијагностичке методе генетског наследна болест омогућавају открити своје (директан приступ, ДНК дијагностика), као и анализира сегрегација болести у породици са маркер лоци ДНК (генетски полиморфизам), која су тесно повезана са оштећеним гена (тј индиректни приступ ДНК дијагностике). Директно или индиректно - било дијагностика ДНА се заснива на методама идентификације строго дефинисан део људске ДНК.

direktne методе

Директне методе ДНК дијагнозу су када је познат кривац ген наследна болест, као познато, и врсте његових мутација. На пример, погодна директне методе бројних болести. Ова Хантингтонова хореја (ектенсион ЦТГ-понавља), фенилкетонурија (Р408В), цистична фиброза (делФ508, главни мутације) и слично. Основна предност директном методом је у потпуности у власништву дијагностичка тачност, и нема потребе да се уради ДНК анализу остатка породице. Ако се установи да мутација у гену који одговара, што омогућава тачно одобрити дијагнозу наслеђивања, одређивање генотипа за остатак оптерећена породице.

Још једна предност директног дијагнозе сматра да идентификује хетерозиготном носач лоших мутација од рођака и родитеља који су умрли од болести. Ово се посебно односи на болести аутозомно рецесивно. Недостаци директним методама такође су доступни. Да их примене, потребно је да знате тачно локализује ненормално гена, ексона-интрон структуру свог спектра и његове мутације. Нису сви моногенски болести данас су добили такву информацију. Информативности директни методе не може сматрати завршеним, јер један те исти ген може имати велики број патолошких мутације која узрокује развој наследних болести.

индиректне методе

Индиректне методе ДНК дијагностици се користе уопште, у другим случајевима, ако је оштећена ген није идентификован, већ само фетуса или ако дијагноза линија није дао резултат (то деси, ако ген комплекс молекуларни организација или великој мери, ако има много патолошких мутације). Индиректне методе извршена сегрегација анализу полиморфних маркера у алелног породици. Маркери се налазе у истој хромозомалној региону или локуса је уско повезан са болести и представљају делеција или инсерција, тачке супституције, понављања, а њихов полиморфизам је последица различитог износа ћелија у блоку.

Најпогоднији за индиректне дијагноза сматра микросателитских и минисателит полиморфизма, који су широко распрострањени у људском геному. њихова вредност изражена у високом садржају информација, ако штета на генетичке удаљености између маркера и ген није превелика. У овом другом случају, тачност процена одређује у великој мери фреквенцију рекомбинације између полиморфне маркером и оштећења. Индиректне дијагностичке методе пружају обавезно прелиминарни корак алела фреквенцијама анализираног студије становништва међу пацијентима и носиоца мутација, плус неопходност утврђивања вероватноћу рекомбинације нонекуилибриум и адхезионих маркера и мутираних алела.

друге методе

Кратки сегменти РНК или ДНК, као и сингл ген визуализованих под микроскопском студије не могу бити, дакле, да се идентификују мутације које су потребне молекуларна генетичка дијагнозе. Постоји "Хуман Геноме Пројецт", као и друге напредак молекуларне генетике знатно проширила могућност дијагнозе наследне болести - и пре и постнатална. Ове методе могу да обезбеде рано откривање и направити предвиђања поли- и моногенских болести, чији је деби одвија у одраслом добу. Нажалост, због техничких могућности молекуларно-генетичких истраживања су понекад изван етичких ограничења која се постављају у вези са наслеђу, посебно када је дијагноза у адолесценцији и детињству.

Структурне и нумеричке хромозомске абнормалности су најчешћи узроци болести и рака, и много аномалија. Хромозомске аберације треба да буду идентификовани, што је важно за породично саветовање - за процену прогнозе, заједно са репродуктивним ризика у будућим трудноћама. анализа хромозома је "златни стандард" генетске дијагнозе, али је ограничена. Само методе молекуларне генетске анализе могу учинити више, јер је коришћен за клонирање технологијом заснованом флуоресцентне ознаке способне њихове велике осетљивости да идентификују суптилне хромозомских промена које је немогуће детектовати класичне цитогенетичких студије. Ове технике су све више шири своје дијагностичке могућности, када испитује, деца са сметњама у развоју, менталном ретардацијом, са многим другим наследним болестима.

налази

То је веома важно за човечанство су структура гена и функција знања, врсте варијабилности, способност да детектује наследне болести које су се догодиле у вези са развојем молекуларне генетике. њене методе имају за циљ проучавање ДНК молекула - и када је нормално, а када је оштећена. Припрема секвенци дезоксирибонуклеинске киселине нуклеотида (ДНК) протеже фазама од пријема узорака за идентификацију појединачних фрагмената. Изолација геномске ДНК из ћелија, ограничење (кидање), амплификације (клонирања), електрофореза фрагмената (одвајање њихове наелектрисање и молекулску тежину агароза гела). Идентификација специфичних фрагмената смештене на површини дискретној траком.

Затим се у тај чин специјалним филтерима, кроз које пролази сваки фрагмент хибридизацију са клонираних ДНК фрагмената или синтетичких радиоактивним сондама је контрола, која ће бити једнака сваки тест узорак. Ако промените положај или дужину поређењу са сондом, уколико нови фрагмент или нестали - све то указује да анализирано ген је прошла реструктурирање у нуклеотидном секвенцом. Постоји осам основних технике молекуларно-генетичких истраживања: секвенцирања (одређивање ДНК секвенце), полимерасе цхаин реацтион (повећање броја секвенци), припрема прајмера познатих гена ДНК клонирање, протеини производња рекомбинантних молекула изведена због молекула рекомбинантне, стварајући комплетну (цоллецтион либрари) клонирани фрагменти који су добијени коришћењем ограничења.